昭衍生物
一、概述
1986年美國食品和藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)了首個單抗藥物。30多年來，抗體藥物領(lǐng)域的發(fā)展日新月異，到目前為止，F(xiàn)DA共批準(zhǔn)了近百個治療性抗體藥物，主要用于治療癌癥、自身免疫性疾病、傳染病等多種疾病。在2021年全球藥品銷售TOP10排行榜上[1]，抗體類藥物占5種，其全球銷售總額接近700億美元，治療性抗體已經(jīng)成為目前制藥行業(yè)增長最快，盈利最大的產(chǎn)品之一。
二、抗體抗腫瘤藥物發(fā)揮作用的基本機(jī)理
圖1. 抗體揮發(fā)作用的方式[2]
抗體抗腫瘤藥物的銷售市場廣闊。據(jù)最新藥品銷售數(shù)據(jù)，2021年銷售額排第一的K藥（Keytruda）銷售額達(dá)到171.8億美元，近年來，Keytruda的適應(yīng)癥仍不斷擴(kuò)大，目前在全球獲批的適應(yīng)癥超30項(xiàng)，包括黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、頭頸部癌、結(jié)直腸癌、宮頸癌等；排第二的O藥（Opdivo）則是全球首個獲批的PD-1抑制劑。自2014年7月獲批以來，Opdivo已在60多個國家和地區(qū)獲批治療10余個癌種，涵蓋肺癌、頭頸癌、胃癌、食管癌、肝癌、腎癌、結(jié)直腸癌等。2021年TOP 10腫瘤單抗藥的全球銷售總額超過430億美元，其中1997年上市的利妥昔單抗，銷售額仍達(dá)到27.7美金，可見抗體抗腫瘤藥物的巨大市場和強(qiáng)大的生命力。2021年腫瘤單抗藥全球銷售額TOP 10榜單見下圖：
表1. 2021年全球TOP10抗腫瘤單抗銷售額
根據(jù)國內(nèi)2021年抗腫瘤市場前三季度藥品銷售數(shù)據(jù)，在TOP 10產(chǎn)品中，包含4款生物藥，這四款單抗產(chǎn)品分別為貝伐珠單抗、曲妥珠單抗、利妥昔單抗、帕妥珠單抗[3]。其中曲妥珠單抗從基礎(chǔ)到臨床的諸多研究均已充分證實(shí)ADCC效應(yīng)是其重要作用機(jī)制，巖藻糖敲除的曲妥珠單抗在體外活性和體內(nèi)藥效學(xué)評價上都具有明顯的優(yōu)勢，有望在不久的將來取代曲妥珠單抗[4]。
目前，2種無巖藻糖修飾的單克隆抗體已被FDA批準(zhǔn)用于癌癥治療。[9]
圖2. 巖藻糖與ADCC活性關(guān)系示意圖[14]
四、去巖藻糖化的成功案例
日本麒麟制藥公司利用同源重組技術(shù)對CHO細(xì)胞中的α-1,6巖藻糖轉(zhuǎn)移酶（FUT8）進(jìn)行基因干擾，得到了三株能夠用于工業(yè)生產(chǎn)完全無巖藻糖抗體的CHO細(xì)胞株，其表達(dá)的抗CD20抗體相對于野生型抗體來說，ADCC效應(yīng)提高100多倍。
2012年3月，日本麒麟制藥公司的Mogamulizumab在日本批準(zhǔn)上市，這是第一個上市的糖蛋白工程抗體，在治療性抗體領(lǐng)域具有里程碑的意義。Mogamulizumab是靶向CC趨化因子受體4（CCR4）的人源化單克隆抗體（mAb），而CCR4經(jīng)常表達(dá)于包括皮膚T細(xì)胞淋巴瘤（CTCL）在內(nèi)的某些血液惡性腫瘤細(xì)胞。協(xié)和麒麟通過降低mogamulizumab的糖鏈結(jié)構(gòu)中的巖藻糖成分，增強(qiáng)了ADCC效應(yīng)，對惡性血液疾病進(jìn)行治療。2020年，Mogamulizumab的全球銷售額仍達(dá)到1.26億美元。
第二個被FDA批準(zhǔn)上市的無巖藻糖修飾的單克隆抗體是羅氏的obinutuzumab，這是第二代anti-CD20單抗，在抗體制備的過程中過表達(dá)N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶3和高爾基體α-甘露糖苷酶Ⅱ，去除了50%的鹽藻糖修飾，從而降低抗體巖藻糖的含量，進(jìn)而增強(qiáng)ADCC效應(yīng)。與第一代產(chǎn)品利妥昔單抗相比，第二代產(chǎn)品obinutuzumab對人FcγRIII的親和力較第一代高50倍，其對表達(dá)CD20的淋巴瘤細(xì)胞系的ADCC效應(yīng)增加了10-100倍，在臨床上也體現(xiàn)了治療的優(yōu)越性。2020年，obinutuzumab全球銷售額約7.24億美元。
五、昭衍生物平臺優(yōu)勢
昭衍生物在自主知識產(chǎn)權(quán)的CHO-K1基礎(chǔ)上進(jìn)行巖藻糖敲除，獲得了完全無巖藻糖的宿主細(xì)胞，通過抗體表征及功能驗(yàn)證，得到了完全無巖藻糖的可應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的細(xì)胞株CHO-K1-TGZ。
抗體表達(dá)驗(yàn)證：利用3個不同靶點(diǎn)轉(zhuǎn)染CHO-K1-TGZ進(jìn)行抗體表達(dá)及功能測試（圖3），通過minipool轉(zhuǎn)染及篩選，補(bǔ)料流加培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)14天后細(xì)胞活率仍大于90%，平均產(chǎn)量為3.88g/L。
抗體親和力測定：利用Biacore檢測抗體與抗原FcγRIIIa親和力，結(jié)果見圖4，通過結(jié)合和解離曲線顯示，去巖藻糖基化的宿主細(xì)胞（CHO-K1-TGZ）表達(dá)的抗體較野生型CHO細(xì)胞（CHO-K1）表達(dá)的抗體與FcγRIIIa結(jié)合的親和力提高了約6倍。
圖4. 表達(dá)抗體與FcγRIIIa (V176)親和力測定
抗體ADCC活性驗(yàn)證：ADCC檢測由去巖藻糖基化的宿主細(xì)胞（CHO-K1-TGZ）表達(dá)的抗體（SF4）和野生型CHO細(xì)胞（CHO-K1）表達(dá)的抗體（對照）對靶細(xì)胞的ADCC效應(yīng)進(jìn)行比較， 結(jié)果顯示由去巖藻糖基化的宿主細(xì)胞表達(dá)的抗體相對于野生型CHO細(xì)胞表達(dá)的抗體介導(dǎo)的NK細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷具有明顯提高，其ADCC EC50值提高了約43倍（圖5）。
圖5. 表達(dá)抗體ADCC活性測定
抗體糖型鑒定：所得抗體經(jīng)PNGase F處理，獲得游離的N-糖鏈；2-AB衍生標(biāo)記后經(jīng)親水作用色譜分離-熒光和質(zhì)譜檢測（HILIC-FLR-MS/MS），圖6所示，通過去巖藻糖基化的宿主細(xì)胞（CHO-K1-TGZ）表達(dá)的抗體未發(fā)現(xiàn)含有巖藻糖的N-糖鏈，巖藻糖被完全敲除；此外主要糖型皆為常見的IgG糖型：G0、G1、G2，不含免疫厡性的糖型、復(fù)雜糖型以及高甘露糖糖型。
圖6. 表達(dá)抗體糖型鑒定
隨著抗體類藥物在市場上占有舉足輕重的地位，細(xì)胞工程研究也有了更加廣泛的應(yīng)用。日本已經(jīng)上市了無巖藻糖抗體，并且有越來越多的無巖藻糖抗體應(yīng)用于臨床研究中。因此，構(gòu)建可以產(chǎn)生此抗體的細(xì)胞株具有很高的實(shí)用價值。昭衍生物擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的巖藻糖敲除宿主細(xì)胞株（CHO-K1-TGZ），已成功應(yīng)用于抗體藥物生產(chǎn)，使抗體藥效得以大幅提升。
參考資料：
1，藥渡數(shù)據(jù)庫.
2，Nitin Agarwal etal; N-Glycosylation of IgG and IgG-Like Recombinant Therapeutic Proteins: Why Is It Important and How Can We Control It? ; Annu. Rev. Chem. Biomol. Eng. 2020. 11:13.1-13.28.
3，藥融云數(shù)據(jù);最高漲237% | 抗腫瘤藥銷售Top10公布（附名單）.
4，Lewis, G. D. et al. Differential responses of human tumor cell lines to anti-p185HER2 monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother 37, 255-263 (1993).
5，Musolino, A. et al. Immunoglobulin G fragment C receptor polymorphisms and clinical efficacy of trastuzumab-based therapy in patients with HER-2/neu-positive metastatic breast cancer. J Clin Oncol 26, 1789-1796, doi:10.1200/JCO.8957 (2008).
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7，Weng, W. K. & Levy, R. Two immunoglobulin G fragment C receptor polymorphisms independently predict response to rituximab in patients with follicular lymphoma. J Clin Oncol 21, 3940-3947, doi:10.1200/JCO.2003.013 (2003).
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9，Shinkawa, T. et al. The absence of fucose but not the presence of galactose or bisecting N-acetylglucosamine of human IgG1 complex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancing antibody-dependent cellular cytotoxicity. The Journal of biological chemistry 278, 3466-3473, doi:10.1074/jbc.M210665200 (2003).
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